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葉綠體分離的操作方法
發(fā)布時(shí)間： 2021-11-17 點(diǎn)擊次數(shù)： 3357次材料與儀器
葉子組織
PBF-Percoll 溶液 山梨醇 BSA HEPES-KOH EDTA
聚碳酸酯離心管步驟
1. 制備 Percoll 梯度
(1) 兩個(gè) 50 ml 的聚碳酸酯離心管中分別加入 25 ml 50% 的 PBF-Percoll 溶液。
50% PBF-Percoll
0.33 mol/L 山梨醇
50 mmol/L HEPES-KOH，pH 8.0
2 mmol/L EDTA
1 mmol/L MgCl2
1 mmol/L MnCI2
50% Percoll (v/v)
3% PEG 6000 (w/v)
1% BSA ( 無脂肪酸，比如 Sigma 的 A7030）
1% Ficoll (w/v)
(2) 29000 g（15600 r/min，SS34 轉(zhuǎn)頭；Sorvall）離心 15 分鐘形成 Pencoll 梯度。
形成的梯度可放 4℃ 過夜。
2. 組織勻漿
(1) 用剪刀收獲葉子組織（照上述方法培養(yǎng)，一個(gè)平盤可得到大約 100 g 的葉組織），切成碎片，移至 1 L 的塑料燒杯中。
(2) 加入冰冷的研磨懸浮緩沖液。在 4℃ 房間內(nèi)，用 Polytron 勻漿器（帶有 PTA-36/2 mol/L 發(fā)生器的 PTA 10/35 型）研磨葉子，每?jī)傻饺齻€(gè) 5 秒脈沖為一循環(huán)，進(jìn)行 6~7 次循環(huán)。
研磨懸浮（GR）緩沖液：
2 mmol/L EDTA 鈉鹽，pH 8.0
1 mmol/L MgCl2
1 mmol/L MnCl2
50 mmol/L HEPES-KOH，pH 8.0
0.33 mol/L 山梨醇
0.5 g/L BSA ( 無脂肪酸）
5 mmol/L 抗壞血酸鈉鹽（用前添加）
(3) 用兩層米拉布（Calbiochem ) 過濾勻漿。將濾液倒入兩個(gè) 250 ml 的離心瓶中。
3. 2600 g（Sorvall GSA 轉(zhuǎn)頭 4000 r/min）離心勻漿 5 分鐘。
4. 小心傾去上清。加入 2 ml GR 緩沖液。用一小駝毛刷輕輕的將瓶子內(nèi)壁的葉綠體刷松。置回轉(zhuǎn)振蕩器的冰上振動(dòng) 5~10 分鐘使團(tuán)塊散開。
5. 將重懸浮的葉綠體加到 Percoll 梯度上。10500 g（Sorvall HB-4 轉(zhuǎn)頭的 8000 r/min）離心 10 分鐘。
6. 抽出梯度介質(zhì)直到底部的條帶。將每一管中葉綠體移至一 50 ml 離心管中，用 1x SH 稀釋至 40 ml。2400 g 離心 2 分鐘（SS34 轉(zhuǎn)頭，4500 r/min）。
7. 用駝毛刷在少量 1x SH 中重懸浮沉淀。將所有葉綠體倒入一個(gè)離心管中，稀釋至 40 ml，2400 g 離心 2 分鐘。
8. 在 1~2 ml 1 x SH 中重懸浮沉淀。
9. 檢測(cè)葉綠素確定葉綠體得率。
(1) 將 5 μl 葉綠體懸液與 995 μl 80% 丙酮在一微量離心管中混勻。
(2) 13000 g 離心 2 分鐘。
(3) 檢測(cè) 663 nm 和 645 nm 處的光吸收值。
(4) 葉綠素的量（mg/ml） = （8.02 A663 + 20.2 A645）/5
10. 葉綠體在液氮中的長(zhǎng)期保存。
(1) 分離好葉綠體后，立刻用含 20% DMSO 的 1x SH 將最后的沉淀重懸至葉綠素濃度為 3~5 mg/ml。
(2) 冰上放置 10 分鐘。
(3) 每 1 ml 為一份，用移液管吸至微量離心管中，快速冷凍，置液氮中保存。
11. 凍存的完整葉綠體的復(fù)蘇。
(1) 室溫融化凍存的葉綠體。用 1x SH 稀釋至葉綠素濃度為 1 mg/ml。
(2) 吸取 1~2 ml 含 35% Percoll 的 1x SH 緩沖液到一個(gè) 15 ml 的離心管中。其上加入融化的葉綠體。13000 g（Sorvall HB-4 轉(zhuǎn)頭，10000 r/min）離心 3 分鐘。棄去上清，用 1x SH 洗沉淀。
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